1020
Syntax Idea: p–ISSN: 2684-6853 e-ISSN: 2684-883X
Vol. 2, No. 12, Desember 2020
OPTIMASI REVERSED-PHASE LIQUID CHROMATOGRAPHY RESIDU
PESTISIDA PADA VARIASI LAJU ALIR DAN KONDISI ISOKRATIK
MENGGUNAKAN SPREADSHEE
Budi Yasri, Harmoko dan Amalia Rakhmawati
Akademi Metrologi dan Instrumentasi, Direktorat Standardisasi dan Pengendalian Mutu
Kementerian Perdagangan Jawa barat, Indonesia.
Email: [email protected], [email protected] dan
[email protected].
Abstract
The multiresidue method (MRM) in pesticide analysis using LC-MS/MS and / or
GC-MS/MS is generally used for pesticide residue analysis because of the large
number of registered and permitted pesticides circulating on the market. The
process of separating analytes in a reversed phased liquid chromatography (RP-
LC) system were affected by several factors, one of which was the mobile phase
flow rate. Optimization was carried out to find the separation conditions for the
optimum isocratic elution by changing the flow rate and composition of the organic
mobile phase. In this study, optimization was carried out with the help of Excel
spreadsheets for 9 mixtures of pesticide residue compounds and the optimization
results were tested against the separation of 120 mixtures of pesticide residue
compounds. The optimal separation obtained in isocratic elution is at flow rate (F)
= 0.3 mL/min and the organic mobile phase composition φ = 0.40. However, the
optimum isocratic conditions obtained were less suitable when used for separation
of 120 mixtures of pesticide residue compounds, because many compounds were
eluted at the beginning and at the same time.
Keywords: pesticide residue, RP-LC, optimization, isocratic elution, flow rate, mobile
phase composition
Abstrak
Metode multiresidu pestisida (MRM) menggunakan LC-MS/MS dan atau GC-
MS/MS secara umum digunakan untuk analisis residu pestisida dalam karena
banyaknya jumlah pestisida terdaftar dan diijinkan beredar di pasaran. Proses
pemisahan analit dalam sistem reversed phased liquid chromatography (RP-LC)
dipengaruhi oleh beberapa faktor dimana salah satunya adalah laju alir fase gerak.
Optimasi dilakukan untuk mencari kondisi pemisahan pada elusi isokratik yang
optimum dengan melakukan perubahan terhadap laju alir dan komposisi fase gerak
organik. Pada penelitian ini dilakukan optimasi dengan bantuan Excel Spreadsheet
terhadap 9 campuran senyawa residu pestisida dan hasil optimasi diuji terhadap
pemisahan 120 campuran senyawa residu pestisida. Pemisahan optimal yang
diperoleh dalam elusi isokratik yaitu pada laju alir (F) = 0,3 mL/menit dan
komposisi fase gerak organik φ = 0,40. Namun, kondisi isokratik optimum yang
diperoleh tersebut kurang cocok jika digunakan untuk pemisahan terhadap 120
Optimasi Reversed-Phase Liquid Chromatography Residu Pestisida
Syntax Idea, Vol. 2, No 12, Desember 2020 1021
campuran senyawa residu pestisida, karena banyak senyawa terelusi di awal dan
pada waktu yang bersamaan.
Kata kunci: residu pestisida, RP-LC, optimasi, elusi isokratik, laju alir, komposisi fase
gerak
Pendahuluan
Pestisida hingga saat ini masih digunakan pada hampir semua jenis tanaman
pangan untuk menanggulangi hama dan penyakit. Karena toksisitas dari pestisida
tersebut terhadap kesehatan, maka ditetapkan Maximum Residue Limits (MRLs)
berdasarkan risk assessment. Uni Eropa yang merupakan importir produk pertanian
Indonesia, secara kontinu melakukan kajian dan merevisi MRL menjadi lebih rendah.
MRLs sebagian besar residu pestisida ditetapkan berdasarkan Limit of Determination
(LOD) yaitu sebesar 0,01 mg/kg. Pada tahun 2020, dalam Commission Regulation
European Union (EU) 2020/1085 (Commission Regulation (EU) 2020/1085, 2020), EU
menurunkan MRL untuk pestisida chlorpyrifos dan chlorpyrifos methyl menjadi 0,01
mg/kg untuk semua bahan pangan. Sedangkan Indonesia berdasarkan Peraturan Menteri
Pertanian Republik Indonesia Nomor 55/Permentan/KR.040/11/2016 (Kementrian
kesehatan RI, 2018) menetapkan MRL chlorpyrifos dan chlorpyrifos methyl berbeda-
beda untuk setiap komoditi dan nilainya jauh lebih tinggi dibandingkan dengan EU
MRLs. Ekspor produk pertanian Indonesia masih mendapatkan notifikasi terkait residu
pestisida dari European RASSF hingga akhir tahun 2018. Publikasi terkait kadar residu
pestisida pada produk pertanian Indonesia sangatlah sedikit. Pada komoditi biji kopi,
beberapa pestisida masih ditemukan pada kadar di atas 0,01 ppm (Harmoko,
Kartasasmita, & Tresnawati, 2015). Anthraquinone juga ditemukan melebihi 0,02 ppm
pada teh (Kartasasmita et al., 2020).
Dengan banyaknya jumlah pestisida terdaftar dan diijinkan beredar di pasaran,
maka penggunaan metode pengujian multi-residue method (MRM) yang mampu
menganalisis sejumlah besar pestisida dalam satu single-run adalah pendekatan yang
paling umum dan paling efisien. Beberapa metode standar resmi MRM seperti EN
15662:2008 (EN 15662:2008, 2008) yang dipublikasikan oleh the European Committee
for Standardization (CEN) atau AOAC 2007.01 (AOAC Official Method 2007.01.,
2007) yang dikeluarkan oleh Association of Official Analytical Chemists (AOAC)
International menggunakan instrumen analisis gas chromatography coupled to mass
spectrometry (GC-MS) dan/atau liquid chromatography coupled to tandem mass
spectrometry (LC-MS/MS) telah digunakan secara luas di seluruh dunia untuk
pengujian residu pestisida dari berbagai golongan dan dari beragam matriks sampel.
LC-MS/MS adalah instrumen analisis yang sangat baik digunakan dalam
penetapan kadar residu pestisida. Liquid Chromatography (LC) lebih disukai daripada
Gas Chromtography (GC) karena pestisida yang digunakan saat ini cukup polar, labil
secara termal atau tidak mudah menguap, dan akibatnya terdeteksi dengan tidak baik di
GC (Farré, Picó, & Barceló, 2014). Oleh karena itu, LC-MS/MS telah menjadi salah
satu alat yang paling baik untuk analisis senyawa organik pada tingkat sub mg/L yang
Budi Yasri, Harmoko dan Amalia Rakhmawati
1022 Syntax Idea, Vol. 2, No 12, Desember 2020
menyediakan sensitivitas, selektivitas, dan spesifisitas diperlukan untuk memenuhi
regulasi negara importir seperti Uni Eropa untuk analisis pestisida dalam sampel air dan
makanan. Dalam LC, RPLC merupakan sistem yang umum digunakan dalam
pemisahan multiresidu pestisida seperti juga terlampir pada metode standar EN
15662:2008 dan AOAC 2007.01. (Lehotay, 2007) Pada sistem RPLC, beberapa
pestisida terelusi dalam waktu singkat dan memiliki bentuk peak yang buruk. Hal ini
mengindikasikan bahwa pestisida tersebut tidak tertahan didalam kolom pada saat
proses pemisahan menggunakan sistem LC. Buruknya pemisaahan tersebut
menyebabkan berkurangnya akurasi pada saat dilakukan kuantisasi hasil pengujian dan
memungkinkan diperoleh Limit of Quantification (LOQ) atau Reporting Limit (RL)
lebih tinggi dari nilai Maximum Residue Limits (MRLs) yang ditetapkan. Beberapa
brand instrumen LC-MS/MS telah melakukan beberapa penelitian melalui eksperimen
yang dipublikasikan melalui Application Note untuk mengatasi masalah tersebut dengan
cara yang berbeda-beda seperti penggunaan divert valve (Kokkalis, E., et. al, 2012),
optimasi temperature values for the ESI source and HSID temperature (Dalmia et al.,
2018), robust online dilution (Mastovska et al., 2017).
Optimasi dalam pemisahan kromatografi merupakan hal yang penting untuk
mencari resolusi terbaik yang diinginkan dalam waktu minimum. Di dalam melakukan
optimasi pada sistem RPLC, ada dua hal yg dilakukan yaitu meningkatkan retensi dan
memaksimalkan peak shape (Nikitas & Pappa-Louisi, 2009). Beberapa parameter
operasional telah dipelajari melalui eksperimen di laboratorium terhadap 150 pestisida
menggunakan LC-MS/MS. Parameter operasional dipelajari pengaruhnya terhadap
waktu retensi, peak shape, dan ionisasi. Namun pada penelitian tersebut digunakan pada
laju alir konstan. (Kmellár, Pareja, Ferrer, Fodor, & Fernández-Alba, 2011). Pendekatan
kemometri telah digunakan untuk optimasi pemisahan enam (6) persitida karbamat.
Laju alir dan persentase fase gerak organik merupakan faktor yang paling berpengaruh
terhadap pemisahan kromatografi (Ouertani, El Atrache, & Hamida, 2016).Temperatur
kolom tidak memberikan pengaruh signifikan terhadap pemisahan (Kmellár et al.,
2011), (Ouertani et al., 2016). Di dalam variabel fase gerak organik sendiri, komposisi
fase gerak (Rafferty, Siepmann, & Schure, 2011) dan modifier juga berpengaruh
terhadap optimasi pemisahan dalam sistem RPLC (Pappa-Louisi, Agrafiotou, &
Georgiadis, 2011). Beberapa software packages dapat digunakan untuk simulasi proses
kromatografi seperti DryLab, PREOPT-W, OSIRIS, MICHROM, CHROMSWORD
(Zisi, Mangipa, Boutou, & Pappa-Louisi, 2018). Simulasi proses pemisahan
kromatografi juga dapat dilakukan menggunakan Matlab (Nilsson, Borgqvist, Axelsson,
& Zacchi, 1999) dan Excel (Fasoula, Nikitas, & Pappa-Louisi, 2017). Software berbasis
Excel Spreadsheet tersebut telah aplikasikan pada pemisahan campuran senyawa
benzena dan fenol (Fasoula et al., 2017) dan campuran senyawa ionik dan non-ionik
(Zisi et al., 2018).
Pada penelitian ini dilakukan optimasi pemisahan terhadap 9 campuran senyawa
residu pestisida pada sistem gradien RP-LC menggunakan Software berbasis Excel
Spreadsheet yang telah dikembangkan sebelumnya (Fasoula et al., 2017). Optimasi
Optimasi Reversed-Phase Liquid Chromatography Residu Pestisida
Syntax Idea, Vol. 2, No 12, Desember 2020 1023
dilakukan pada variasi laju alir komposisi fase gerak pada kondisi isokratik dan single
linear organic modifier-gradients. Kondisi pemisahan yang optimum kemudian
diaplikasikan pada pemisahan 120 pestisida dalam matriks kopi, kakao, lada, dan teh
yang termasuk dalam difficult or unique matriks grup komoditi (Document No
SANTE/11813/2017, 2017). Keempat komoditi tersebut merupakan produk pertanian
Indonesia yang diekspor ke EU.
Metode Penelitian
a. Bahan Kimia dan Reagen
Standar analisis pestisida dibeli dari Sigma Aldrich - Amerika Serikat (AS) dan
Chem Service-AS. Metanol (grade HPLC), asetonitril (grade HPLC), asam format,
asam asetat, heptana, etil asetat diperoleh dari Merck - Jerman. Bulk sorben natrium
klorida (NaCl), amina sekunder primer (PSA), Bondesil C18, MgSO4, dibeli dari
Agilent - AS. Sistem pemurnian air Arioso (Cole-Parmer Scientific - AS) digunakan
untuk menghasilkan air Ultrapure.
b. Larutan Pestisida
Larutan standar stok individu pestisida dengan konsentrasi sekitar 1000 mg/L
disiapkan dengan menimbang sekitar 10 mg dalam labu ukur 10 mL dan dilarutkan
dalam asetonitril. Larutan standar disimpan dalam gelap pada suhu -20 ⁰C.
Selanjutnya dibuat 1 mg/L campuran 9 pestisida dan 120 pestisida dengan
mengencerkan larutan standar stok dengan asetonitril. Setelah itu, larutan standar
campuran 10 mg/L yang digunakan dalam percobaan laboratorium awal dibuat
dengan mengencerkan larutan standar 1 mg/L. Sembilan pestisida yang digunakan
dalam perilaku kromatografi adalah cyromazine, methamidophos, imidacloprid,
acetamiprid, thiacloprid, propoxur, carbaryl, bupirimate, dan azoxystrobine.
c. Ekstraksi Sampel
Ekstrak sampel biji kopi hijau, biji kakao, lada hitam, dan teh dibuat dengan
metode QuEChERS termodifikasi. Metode pengujian (Harmoko et al., 2015)
Digunakan untuk mendapatkan sampel ekstrak biji kopi hijau, biji kakao, lada hitam,
dan teh yang bersih. Selanjutnya, larutan campuran standar 120 pestisida dalam
setiap matriks sampel dibuat dengan pengenceran larutan standar 1 mg/L dengan
ekstrak sampel bersih. Larutan standar ini kemudian digunakan untuk
mengkonfirmasi kondisi pemisahan optimal yang diperoleh dari hasil optimasi.
d. LC
Pemisahan residu pestisida dilakukan dengan menggunakan sistem Ultra HPLC
1290 Infinity (UHPLC) (Agilent Technologies - AS) dan kolom HPLC 100-3 mm
dengan penutup ujung Chromolith® Performance RP-18 (Merck - Jerman). Fase
gerak A adalah air yang mengandung asam format 0,1% dan fase gerak B adalah
asetonitril. Temperatur kolom dijaga pada suhu konstan 25 ⁰C. Perilaku kromatografi
zat terlarut diselidiki melalui percobaan laboratorium pada laju aliran fase gerak 0,2,
0,3, dan 0,5 mL/menit. Proses isokratik dilakukan dengan fraksi volume fase gerak
organik yang berbeda (φ = 0,4, 0,5, dan 0,6) dalam laju alir yang berbeda. Proses
Budi Yasri, Harmoko dan Amalia Rakhmawati
1024 Syntax Idea, Vol. 2, No 12, Desember 2020
single linear organic modifier-gradients dilakukan dari fraksi volume awal φ
0
= 0,2
hingga yang terakhir φ
f
= 1,0. Waktu gradien ditetapkan 10, 15, dan 20 menit dengan
waktu mulai (t
in
= 0 menit).
e. Mass Spectrometry (MS)
Analisis MS dilakukan dengan menggunakan spektrometer massa triple
quadrupole, AB Sciex 3500 (AB Sciex - AS). MRM dioperasikan dalam mode
ionisasi positif. Parameter operasi Collision gas (CAD), Curtain gas (CUR), tegangan
IonSpray (IS) dan temperatur (TEM) dari sumber ion masing-masing ditetapkan pada
8V, 10 V, 5000 dan 500. Tegangan IonSpray (IS) dan suhu (TEM) dari sumber ion
ditetapkan masing-masing pada 5000 dan 500. Sumber Ion gas 1 (GS1) dan gas 2
(GS2) ditetapkan masing-masing pada 40 dan 60.
Hasil dan Pembahasan
a. Pengaruh Laju Aliran Fase Bergerak terhadap Retensi Residu Pestisida
Faktor rentensi k zat terlarut terhadap variasi laju aliran pada konstanta dapat
dijelaskan dengan persamaan (1) (Nikitas & Pappa-Louisi, 2009).
di mana t
o1
adalah waktu penahanan kolom. Tabel 1 di bawah ini menunjukkan
pengaruh laju alir pada retensi residu pestisida. Data percobaan dalam kondisi
isokratik dilakukan pada laju alir 0,2, 0,3, dan 0,4 mL/menit pada φ ACN = 0,4,
0,5, dan 0,6. Zat terlarut dielusi lebih cepat ketika laju alir dan komposisi fase gerak
organik meningkat. Pada laju alir 0,4 mL/menit, lebih banyak zat terlarut yang
dielusi pada waktu yang sama atau berdekatan. Hal ini akan mempengaruhi resolusi
serta respon sinyal ke instrumen (signal supression).
Tabel 1
Waktu retensi eksperimental isokratik (dalam menit) dari residu pestisida yang
diperoleh pada laju alir dan komposisi fase gerak organik yang berbeda
Zat Terlarut
Laju Alir 0,2 mL/menit
Laju Alir 0,3 mL/menit
Laju Alir 0,4 mL/menit
φ =0,4
φ =0,4
φ =0,6
φ
=0,4
φ
=0,5
φ
=0,6
Cyromazin
2,82
1,89
1,84
1,41
1,39
1,36
Methamidophos
3,19
2,13
2,11
1,59
1,59
1,58
Imidacloprid
4,09
2,69
2,32
2,02
1,84
1,73
Acetamiprid
4,13
2,79
2,33
2,08
1,86
1,74
Thiacloprid
4,71
3,15
2,42
2,37
2,0
1,81
Propoxur
6,39
4,25
2,72
3,19
2,4
2,04
Carbaryl
7,36
4,87
2,83
3,64
2,58
2,11
Bupirimate
9,29
6,15
3,22
4,63
3,02
2,41
Azoxystrobine
17,61
11,71
3,56
8,9
4,08
2,67
Optimasi Reversed-Phase Liquid Chromatography Residu Pestisida
Syntax Idea, Vol. 2, No 12, Desember 2020 1025
b. Optimasi dengan Variasi Laju Alir
Optimasi pemisahan campuran zat terlarut dengan bantuan komputer (Zisi et
al., 2018), (Fasoula et al., 2017) dilakukan dengan studi eksperimen laboratorium
tentang perilaku kromatografi zat terlarut pada beberapa kondisi isokratik;
penentuan parameter model retensi yang dapat disesuaikan dengan menyesuaikan
data retensi eksperimen dari masing-masing analit; pemodelan bentuk peak setiap
analit; penentuan kondisi pemisahan optimal, uji akurasi kondisi optimal dengan
membandingkan kromatogram eksperimental dan kromatogram prediksi.
Data retensi isokratik tiap zat terlarut pada beberapa laju alir selanjutnya
dilengkapi dengan model retensi kuadrat dalam sistem RPLC (Persamaan 2).
Dalam persamaan ini terdapat tiga parameter yang dapat diatur yaitu a, b, dan c.
Model peak kromatografi Gaussian dengan tinggi, lebar, dan parameter
respon detektor adalah h, D, dan y, masing-masing, dinyatakan dalam Persamaan 3,
digunakan untuk menyesuaikan bentuk peak setiap zat terlarut dalam komposisi
fase gerak organik yang berbeda, φ.
dimana
Nilai parameter yang bisa diatur adalah c
0
, c
1
, c
2
, h
0
, h
1
, h
2
, D
0
, D
1
, dan D
2
kemudian ditransfer ke spreedsheet untuk digunakan dalam optimasi pada kondisi
isokratik dan single linear organic modifier-gradients.
c. Optimasi dengan Kondisi Isokratik
Kondisi optimum pemisahan yang diperoleh dari optimasi menggunakan
spreadsheet pada kondisi isokratik adalah pada φ = 0,50 untuk aliran 0,2 mL menit,
φ = 0,40 untuk aliran 0,3 mL/menit, φ = 0,36 untuk aliran 0,4 mL/menit. Laju alir
0,3 mL/menit memberikan pemisahan terbaik dibandingkan dengan laju aliran 0,2
dan 0,4 mL/menit. Gambar 1 di awah ini menunjukkan kromatogram dari 9
pestisida (a) dan 120 pestisida (b) yang bekerja pada kondisi isokratik optimum (F
= 0,3 mL/menit, φ = 0,40). Pada gambar terlihat bahwa multiplikasi pestisida tidak
sesuai untuk kondisi isokratik, karena banyak zat terlarut yang terelusi pada awal
elusi dan bersamaan pada waktu yang sama.
Budi Yasri, Harmoko dan Amalia Rakhmawati
1026 Syntax Idea, Vol. 2, No 12, Desember 2020
Gambar 1.
Kromatogram LC-MS/MS dari campuran (A) 9 pestisida dan (B) 120 pestisida
pada konsentrasi 10 µg/L diperoleh pada kondisi isokratik optimal (F = 0,3
mL/menit, φ = 0,40)
Kesimpulan
Pemisahan optimal dalam elusi isokratik diperoleh pada F = 0,3 mL/menit dan φ =
0,40. Namun, kondisi pemisahan tersebut kurang sesuai jika digunakan untuk
pemisahan terhadap 120 senyawa, karena banyak senyawa terelusi pada awal elusi dan
pada waktu yang bersamaan. Optimasi pemisahan pada kondisi gradien perlu dilakukan
lebih lanjut.
BIBLIOGRAFI
Dalmia, Avinash, Cudjoe, Erasmus, Astill, Toby, Jalali, Jacob, Weisenseel, Jason P.,
Qin, Feng, Murphy, Molly, Ruthenberg, Travis, Shelton, C. T., & Woodbridge, O.
N. (2018). A Single Cannabis LC/MS/MS Method to Meet California Pesticide and
Mycotoxin Residues Regulatory Requirements.
Farré, M., Picó, Y., & Barceló, D. (2014). Application of Ultra-High Pressure Liquid
Chromatography Linear Ion-Trap Orbitrap to Qualitative and Quantitative
Assessment of Pesticide Residues. Journal of Chromatography A, 1328, 66–79.
Fasoula, S., Nikitas, P., & Pappa-Louisi, A. (2017). Teaching Simulation and
Computer-Aided Separation Optimization in Liquid Chromatography by Means of
Illustrative Microsoft Excel spreadsheets. ACS Publications.
Harmoko, Harmoko, Kartasasmita, Rahmana Emran, & Tresnawati, Astika. (2015).
QuEChERS Method for the Determination of Pesticide Residues in Indonesian
Green Coffee Beans Using Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry.
Journal of Mathematical and Fundamental Sciences, 47(3), 296–308.
Kartasasmita, Rahmana E., Kurniawan, Fransiska, Amelia, Tasia, Dewi, Chandrini M.,
Harmoko, Harmoko, & Pratama, Yoga. (2020). Determination of Anthraquinone in
Some Indonesian Black Tea and Its Predicted Risk Characterization. ACS Omega,
Optimasi Reversed-Phase Liquid Chromatography Residu Pestisida
Syntax Idea, Vol. 2, No 12, Desember 2020 1027
5(32), 20162–20169.
Kementrian kesehatan RI. (2018). Hasil utama riskesdas 2018. 61.
Kmellár, Béla, Pareja, Lucía, Ferrer, Carmen, Fodor, Péter, & Fernández-Alba, Amadeo
R. (2011). Study of The Effects of Operational Parameters on Multiresidue
Pesticide Analysis by LC–MS/MS. Talanta, 84(2), 262–273.
Lehotay, S. (2007). AOAC official method 2007.01 Pesticide Residues in Foods by
Acetonitrile Extraction and Partitioning with Magnesium Sulfate. Journal of
AOAC International, 90(2), 485–520.
Mastovska, K., Zulkoski, J., Deal, E., Vaclavik, L., Koesukwiwat, U., Halbardier, J. F.,
Zweigenbaum, J., & Glauner, T. (2017). Improved LC-MS/MS pesticide Residue
Analysis Using Triggered MRM and On-Line Dilution. Application Note 5991-
7193EN.
Nikitas, Panagiotis, & Pappa-Louisi, Adriani. (2009). Retention Models For Isocratic
and Gradient Elution in Reversed-Phase Liquid Chromatography. Journal of
Chromatography A, 1216(10), 1737–1755.
Nilsson, Bernt, Borgqvist, Per, Axelsson, Anders, & Zacchi, Guido. (1999). Simulation
of Chromatographic Processes Using MATLAB. Computers & Chemical
Engineering, 23, S715–S718.
Ouertani, Randa, El Atrache, Latifa Latrous, & Hamida, Néjib Ben. (2016).
Chemometrically Assisted Optimization and Validation of Reversed Phase Liquid
Chromatography Method for The Analysis of Carbamates Pesticides.
Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 154, 38–44.
Pappa-Louisi, Adriani, Agrafiotou, P., & Georgiadis, I. (2011). Separation Optimization
in Reversed-Phase Liquid Chromatography by Using Alkanol Additives in the
Mobile Phase: Application to Amino Acids. Talanta, 85(4), 2241–2245.
Rafferty, Jake L., Siepmann, J. Ilja, & Schure, Mark R. (2011). Mobile Phase Effects in
Reversed-Phase Liquid Chromatography: A Comparison of Acetonitrile/Water and
Methanol/Water Solvents as Studied by Molecular Simulation. Journal of
Chromatography A, 1218(16), 2203–2213.
Zisi, Chrysostomi, Mangipa, Athina Maria, Boutou, Eleftheria, & Pappa-Louisi,
Adriani. (2018). Separation Optimization of a Mixture of Ionized and Non-Ionized
Solutes Under Isocratic and Gradient Conditions in Reversed-Phase HPLC by
Means of Microsoft Excel Spreadsheets. Separations, 5(1), 19.